Bestrophin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404183-ACT

Il gene umano **BEST1** codifica la bestrofina-1, un canale anionico attivato dal Ca2+ localizzato prevalentemente sulla membrana basolaterale dell’epitelio pigmentato retinico (RPE). La bestrofina contribuisce al flusso di cloruro e bicarbonato, all’omeostasi ionica e dei fluidi dell’epitelio e all’accoppiamento dei segnali intracellulari di Ca2+ con la conduttanza di membrana che sostiene i processi di trasporto transepiteliale. L’attività di BEST1 interagisce con vie che regolano il potenziale di membrana, il volume cellulare e il metabolismo retinico attraverso la modulazione dei microambienti ionici. Le varianti genetiche o la disregolazione di BEST1 sono associate a patologie retiniche ereditarie, rendendolo un bersaglio utile per studiare la fisiologia dell’RPE e i meccanismi della degenerazione retinica in modelli cellulari.

Bestrophin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BEST1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Bestrophin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BEST1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BEST1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Bestrophin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BEST1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Bestrophin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Bestrophin nelle cellule tumorali con espressione di BEST1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.