Bcl-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400025-ACT

BCL2 codifica Bcl-2, una proteina integrale della membrana esterna mitocondriale che sopprime l’apoptosi limitando la permeabilizzazione della membrana esterna del mitocondrio e riducendo il rilascio di citocromo c. Sequestrando le proteine pro-apoptotiche BH3-only e antagonizzando l’attivazione di BAX/BAK, Bcl-2 funge da nodo chiave nella via intrinseca dell’apoptosi e modula le risposte cellulari a stress, deprivazione di fattori di crescita e danno al DNA. L’attività di BCL2 interseca reti di segnalazione pro-sopravvivenza, incluse le vie PI3K–AKT e MAPK, e influenza la dinamica mitocondriale e l’omeostasi redox. Un’espressione deregolata di BCL2 è frequentemente associata a una ridotta predisposizione all’apoptosi nei tumori e contribuisce alla sopravvivenza anomala di popolazioni cellulari maligne e immunitarie, rendendolo di ampia rilevanza per studi su oncogenesi, risposta ai trattamenti e omeostasi immunitaria.

Bcl-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BCL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Bcl-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BCL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BCL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Bcl-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BCL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Bcl-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Bcl-2 nelle cellule tumorali con espressione di BCL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.