B7-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419570-ACT

Il gene murino Cd80 codifica il ligando co-stimolatorio B7-1 (CD80), un regolatore chiave dell’immunità adattativa espresso sulle cellule presentanti l’antigene, quali cellule dendritiche, macrofagi e cellule B attivate. B7-1 interagisce con CD28 promuovendo il priming dei linfociti T, la produzione di citochine e l’espansione clonale, e si lega a CTLA-4 per modulare le soglie di attivazione e mantenere l’omeostasi immunitaria. Attraverso queste interazioni recettoriali, Cd80 influenza la formazione della sinapsi immunologica, i programmi di segnalazione guidati dall’antigene e l’equilibrio tra risposte dei linfociti T effettrici e regolatorie. Un’espressione deregolata di CD80 è stata associata ad alterazioni dell’attivazione immunitaria nell’infiammazione e nell’autoimmunità e può plasmare i microambienti immunitari antitumorali in modelli murini di malattia.

B7-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cd80 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

B7-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cd80 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cd80, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di B7-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cd80 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da B7-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via B7-1 nelle cellule tumorali con espressione di Cd80 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.