ATP5B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401009-ACT

ATP5B codifica la subunità beta dell’ATP sintasi mitocondriale (Complesso V), un componente catalitico centrale del settore F1 che accoppia la forza proton-motrice alla produzione di ATP durante la fosforilazione ossidativa. Sostenendo la bioenergetica cellulare e il mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale, ATP5B influenza processi quali l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno, la suscettibilità all’apoptosi e l’adattamento metabolico. Un’alterata espressione o funzione delle subunità dell’ATP sintasi, inclusa ATP5B, è stata associata a fenotipi di disfunzione mitocondriale osservati nella neurodegenerazione, nello stress cardiometabolico e nella riprogrammazione metabolica legata al cancro, rendendola un readout comune negli studi di biologia mitocondriale. ATP5B è quindi frequentemente analizzata nei pathway che collegano l’attività della catena di trasporto degli elettroni alla domanda di ATP, al controllo di qualità mitocondriale e alla segnalazione di risposta allo stress.

ATP5B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP5B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP5B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP5B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP5B nelle cellule tumorali con espressione di ATP5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.