ATP13A3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413173-ACT

ATP13A3 codifica una ATPasi di tipo P5 localizzata prevalentemente nelle membrane endolisosomiali, dove si ritiene regoli l’omeostasi delle poliamine e dei cationi e supporti il traffico vescicolare. Influenzando la funzione lisosomiale, la dinamica dei lipidi di membrana e i processi di trasporto dipendenti dagli ioni, ATP13A3 può incidere sul flusso autofagia-lisosoma, sulla maturazione endosomiale e sulle risposte cellulari allo stress. Un’alterata espressione di ATP13A3 è stata collegata in letteratura a fenotipi della biologia vascolare e a contesti di segnalazione proliferativa, rendendola rilevante per studi sulla funzione endoteliale, la detossificazione intracellulare e l’adattamento metabolico. La sua connettività di via con il controllo qualità degli organelli e con i meccanismi di trasporto la rende anche un nodo utile per indagare come la disfunzione lisosomiale contribuisca a stati cellulari complessi associati alle malattie.

ATP13A3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP13A3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP13A3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP13A3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP13A3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP13A3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP13A3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP13A3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP13A3 nelle cellule tumorali con espressione di ATP13A3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.