Atg16 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429488-ACT

Il gene murino Atg16l1 codifica Atg16, un componente fondamentale del complesso ATG12–ATG5–ATG16L1 che coordina la biogenesi dell’autofagosoma attraverso la lipidazione di LC3 e l’espansione del fagoforo. Questa proteina collega i segnali a monte legati a nutrienti e stress all’autofagia selettiva e non selettiva, contribuendo al controllo di qualità mitocondriale, alle risposte antimicrobiche e agli output di segnalazione infiammatoria. Un’alterata funzione di ATG16L1 è associata alla biologia della barriera intestinale e alla regolazione dell’immunità innata, rendendola rilevante per studi sulle interazioni ospite–microbo, sui fenotipi infiammatori e sull’adattamento allo stress intrinseco cellulare. Nei sistemi sperimentali, la perturbazione di Atg16l1 può modulare il flusso autofagico e le vie citochiniche a valle, supportando l’analisi meccanicistica dell’omeostasi dipendente dall’autofagia.

Atg16 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Atg16l1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg16 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Atg16l1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Atg16l1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Atg16l1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg16 nelle cellule tumorali con espressione di Atg16l1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.