ARHGEF5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409563-ACT

ARHGEF5 codifica un fattore di scambio dei nucleotidi guaninici (GEF) per Rho che attiva le GTPasi della famiglia Rho, collegando i segnali provenienti dai recettori di superficie cellulare al rimodellamento del citoscheletro di actina. Attraverso la regolazione delle vie guidate da RhoA, ARHGEF5 influenza l’adesione cellulare, la polarità e la motilità, e contribuisce alla dinamica delle adesioni focali e alla formazione delle fibre di stress. Questo asse di segnalazione si interfaccia con vie che controllano proliferazione e sopravvivenza, rendendo ARHGEF5 un nodo utile per studiare il controllo del citoscheletro e la trasduzione del segnale. Alterazioni nella regolazione delle GTPasi Rho sono state associate a fenotipi invasivi e a un’organizzazione tissutale aberrante, supportando l’indagine di ARHGEF5 in modelli rilevanti per la malattia di migrazione e crescita deregolate.

ARHGEF5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARHGEF5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARHGEF5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARHGEF5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARHGEF5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARHGEF5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARHGEF5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARHGEF5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARHGEF5 nelle cellule tumorali con espressione di ARHGEF5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.