ARH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-410678-ACT-2

L’ADPRH umano codifica l’ADP-ribosilarginina idrolasi 1 (ARH1), un enzima citosolico che rimuove il mono-ADP-ribosio dai residui di arginina nelle proteine, invertendo l’ADP-ribosilazione specifica dell’arginina e modulando il turnover cellulare dell’ADP-ribosio. Bilanciando le modificazioni mediate dalle ART, ARH1 contribuisce alla regolazione delle risposte allo stress, della trasduzione del segnale e dell’omeostasi proteica nell’ambito più ampio delle vie di mono-ADP-ribosilazione NAD⁺-dipendenti. Dinamiche di ADP-ribosilazione alterate che coinvolgono ADPRH sono state associate, in sistemi sperimentali, a una diversa suscettibilità a modificazioni mediate da tossine e a fenotipi rilevanti per la soppressione tumorale e la segnalazione infiammatoria. L’editing genetico di ADPRH consente studi meccanicistici sull’ADP-ribosilazione reversibile, sul cross-talk di via con le reti di segnalazione del danno al DNA e dell’immunità e su screening di genomica funzionale che esaminano il controllo delle modificazioni post-traduzionali.

ARH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADPRH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADPRH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADPRH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADPRH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARH1 nelle cellule tumorali con espressione di ADPRH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.