AQP11 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403957-ACT

L’AQP11 umano codifica l’acquaporina-11, un membro atipico della famiglia delle acquaporine che si localizza prevalentemente nelle membrane intracellulari e contribuisce all’omeostasi cellulare dell’acqua e di piccoli soluti. L’attività di AQP11 è collegata al mantenimento dell’integrità del reticolo endoplasmatico, alla regolazione dell’equilibrio osmotico e a vie di proteostasi che influenzano le risposte cellulari allo stress e la funzione degli organelli. Nel rene e in altri tessuti secretori o metabolicamente attivi, un’alterata espressione di AQP11 è stata associata a una compromissione dell’omeostasi delle cellule tubulari e a una maggiore suscettibilità a fenotipi di danno correlati allo stress. Queste proprietà rendono AQP11 un bersaglio utile per studiare il trasporto di membrana, i processi associati al RE e ruoli dipendenti dal contesto nella fisiologia cellulare rilevante per la malattia.

AQP11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AQP11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AQP11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AQP11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AQP11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AQP11. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AQP11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AQP11 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AQP11 nelle cellule tumorali con espressione di AQP11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.