APPL1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-428481-LAC

Appl1 codifica APPL1, una proteina adattatrice endosomiale che collega gli endosomi precoci positivi per Rab5 alla trasduzione del segnale, integrando stimoli provenienti dai recettori tirosin-chinasici e dai recettori dell’adiponectina. Attraverso interazioni con AKT e altri intermediari di segnalazione, APPL1 modula la via PI3K–AKT, la sensibilità all’insulina e l’omeostasi del glucosio, influenzando inoltre il traffico endocitico e il riciclo dei recettori. Nelle cellule murine, APPL1 è stata utilizzata per studiare il cross-talk tra vie metaboliche e vie attivate da fattori di crescita, inclusa la regolazione di risposte associate ad AMPK e MAPK. La disregolazione della segnalazione dipendente da APPL1 è rilevante per la ricerca meccanicistica su disfunzioni metaboliche, biologia vascolare e fenotipi associati all’infiammazione.

Le particelle di attivazione lentivirale APPL1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Appl1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale APPL1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Appl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di APPL1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Appl1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.