AP-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404336-ACT

TFAP4 codifica l’Activating Enhancer-Binding Protein 4 (AP-4), un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix con leucine zipper che si lega ai motivi E-box e regola programmi che controllano proliferazione, differenziamento e progressione del ciclo cellulare. AP-4 integra segnali provenienti da vie oncogeniche e di sviluppo, incluse le reti trascrizionali guidate da MYC, e influenza la transizione epitelio-mesenchimale, la migrazione e l’adattamento metabolico attraverso i geni bersaglio a valle. Un’espressione deregolata di TFAP4 è stata associata ad alterazioni del controllo della crescita e a fenotipi invasivi in molteplici contesti rilevanti per il cancro, rendendolo utile per studiare il riassetto trascrizionale e la regolazione genica dipendente dal contesto. In quanto regolatore nucleare che si lega al DNA, AP-4 rappresenta un nodo facilmente investigabile per analizzare l’attività di promotori/enhancer e il controllo dell’espressione genica dipendente dalla cromatina.

AP-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFAP4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AP-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFAP4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFAP4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AP-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFAP4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AP-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AP-4 nelle cellule tumorali con espressione di TFAP4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.