AP-3β Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419135-ACT

Ap3b1 codifica la subunità beta del complesso proteico adattatore 3 (AP-3β), un componente chiave del traffico associato alla clatrina che smista il carico transmembrana dagli endosomi ai lisosomi e agli organelli correlati ai lisosomi. Nelle cellule murine, le vie dipendenti da AP-3 supportano la biogenesi regolata delle vescicole, la localizzazione delle proteine di membrana e la consegna del carico, aspetti importanti per l’omeostasi endolisosomiale e per compartimenti secretori specializzati. L’alterazione della funzione del complesso AP-3 è associata a difetti nel trasporto intracellulare e nella maturazione degli organelli, processi che si intersecano con la biologia dei granuli delle cellule immunitarie e con la proteostasi neuronale. Di conseguenza, Ap3b1 è spesso studiato in modelli di disfunzione del traffico vescicolare, di fenotipi legati alla pigmentazione e ai granuli, e di meccanismi neuro-immuni che coinvolgono organelli correlati ai lisosomi.

AP-3β Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ap3b1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AP-3β Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ap3b1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ap3b1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AP-3β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ap3b1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AP-3β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AP-3β nelle cellule tumorali con espressione di Ap3b1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.