AGPS Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-404604-ACT-2

Il gene umano AGPS (alkylglycerone phosphate synthase) codifica un enzima perossisomiale che catalizza una tappa impegnata della biosintesi dei fosfolipidi eterei (plasmalogeni), convertendo l’acil-diidrossiacetone fosfato in alchil-diidrossiacetone fosfato e contribuendo così alla composizione delle membrane e alla segnalazione mediata dai lipidi. L’attività di AGPS collega il metabolismo lipidico dipendente dai perossisomi a vie più ampie che regolano le risposte allo stress ossidativo, l’omeostasi degli organelli e il rimodellamento dei lipidi attraverso le interfacce tra reticolo endoplasmatico e mitocondri. L’alterazione della funzione di AGPS è implicata in disturbi della biogenesi dei perossisomi e da carenza di plasmalogeni, inclusi i fenotipi dello spettro della condrodisplasia puntata rizomelica, rendendolo un bersaglio rilevante per lo studio dei meccanismi di patologia neuroevolutiva e scheletrica. L’editing genetico o la perturbazione di AGPS è utile per generare modelli cellulari con cui interrogare il flusso lipidico perossisomiale, le dinamiche di membrana dipendenti dai plasmalogeni e gli effetti a valle sulla fisiologia e sul metabolismo cellulari.

AGPS Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AGPS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AGPS Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AGPS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AGPS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AGPS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AGPS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AGPS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AGPS nelle cellule tumorali con espressione di AGPS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.