Adenosine A2B-R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401402-ACT

ADORA2B codifica il recettore umano dell’adenosina A2B (A2B-R), un recettore accoppiato a proteine G a bassa affinità, indotto in condizioni di ipossia e di stress infiammatorio, quando l’adenosina extracellulare si accumula. A2B-R segnala principalmente tramite Gs aumentando il cAMP e può anche accoppiarsi a Gq per mobilizzare il calcio intracellulare, attivando programmi a valle come PKA/CREB, MAPK/ERK e la segnalazione PI3K. Attraverso queste vie, ADORA2B modula la funzione di barriera endoteliale, le risposte angiogeniche e fibrotiche e la produzione di citochine nei compartimenti immunitario e stromale. Un’attività deregolata di ADORA2B è stata associata a stati infiammatori cronici, al rimodellamento tissutale guidato dall’ipossia e alla segnalazione nel microambiente tumorale, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico per studi sulla segnalazione recettoriale e sulla biologia del microambiente.

Adenosine A2B-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADORA2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Adenosine A2B-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADORA2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADORA2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Adenosine A2B-R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADORA2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Adenosine A2B-R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Adenosine A2B-R nelle cellule tumorali con espressione di ADORA2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.