ADAR3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402742-ACT

ADARB2 codifica ADAR3, una adenosina deaminasi arricchita nei neuroni che agisce sull’RNA, si lega all’RNA a doppio filamento ed è associata alla regolazione delle dinamiche di editing dell’RNA nel sistema nervoso. Nell’ambito della regolazione genica post-trascrizionale, l’editing A-to-I dell’RNA influenza la stabilità dei trascritti, lo splicing alternativo, il targeting da parte dei miRNA e il potenziale codificante, contribuendo così a modellare la segnalazione sinaptica e l’eccitabilità neuronale. Sebbene ADAR3 sia generalmente considerata cataliticamente più limitata rispetto ad ADAR1/ADAR2, può modulare l’accesso ai substrati di RNA ed è studiata nel contesto della biologia delle malattie neuroevolutive e neuropsichiatriche. Alterazioni dei profili di editing dell’RNA associate all’attività della famiglia ADAR sono state riportate in diversi disturbi neurologici e nei tumori cerebrali, stimolando studi meccanicistici sulla regolazione dell’RNA dipendente da ADAR3 in cellule umane.

ADAR3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADARB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADAR3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADARB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADARB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADAR3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADARB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADAR3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADAR3 nelle cellule tumorali con espressione di ADARB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.