A33 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404457-ACT

GPA33 codifica la glicoproteina umana A33, una molecola di superficie cellulare transmembrana a singolo passaggio, implicata nella differenziazione dell’epitelio e nel mantenimento dell’adesione intercellulare. A33 è arricchita nell’epitelio intestinale ed è utilizzata come marcatore associato alla linea cellulare in studi sull’identità delle cellule gastrointestinali, sul traffico di membrana e sulla biologia della barriera epiteliale. I suoi pattern di espressione e la sua regolazione alterata vengono spesso valutati nella ricerca sul carcinoma colorettale e su altre patologie gastrointestinali per indagare i cambiamenti nei programmi epiteliali associati al tumore. GPA33/A33 rappresenta quindi un bersaglio idoneo per analizzare la biologia degli antigeni di superficie e gli stati di segnalazione epiteliale in modelli cellulari pertinenti.

A33 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPA33 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

A33 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPA33 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPA33, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di A33. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPA33 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da A33 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via A33 nelle cellule tumorali con espressione di GPA33 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.