6CKine Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403041-ACT

O CCL21 humano codifica a quimiocina 6CKine, um ligante homeostático de CCR7 que direciona células dendríticas e células T naïve para órgãos linfoides secundários e contribui para a organização do tecido linfoide. Ao estabelecer gradientes quimiotáticos, o CCL21 regula o tráfego de leucócitos, a comunicação entre endotélio linfático e células imunes e o posicionamento de células apresentadoras de antígeno durante a vigilância imunológica. Esse eixo interage com a sinalização por GPCR, a remodelação do citoesqueleto e programas de adesão que moldam a migração e a compartimentalização celular. A desregulação da sinalização CCL21/CCR7 tem sido associada a alterações no recrutamento de células inflamatórias e à remodelação do microambiente imune em condições como inflamação crônica e linfangiogênese associada a tumores, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos em imunologia.

6CKine O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCL21 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

6CKine O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCL21 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCL21, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 6CKine. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCL21 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 6CKine no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 6CKine em células tumorais com expressão de CCL21 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.