γ Enolase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400763-ACT

ENO2 codifica la γ-enolasi umana (enolasi neurone-specifica, NSE), una metalloenzima glicolitica che catalizza l’interconversione tra 2-fosfoglicerato e fosfoenolpiruvato, sostenendo la produzione di ATP e il flusso metabolico. Oltre al suo ruolo metabolico, la γ-enolasi è arricchita nei neuroni e nelle cellule neuroendocrine ed è associata alle risposte allo stress cellulare, ai programmi di differenziamento e al mantenimento dell’integrità neuronale. L’espressione di ENO2 è spesso utilizzata per studiare gli stati di linea neuroendocrina, la riprogrammazione metabolica e l’alterazione della glicolisi in contesti associati alla malattia, inclusi i disturbi neurologici e la biologia tumorale. In quanto nodo di via nel metabolismo centrale del carbonio, ENO2 offre un punto di accesso maneggevole per indagare come il controllo glicolitico si interfacci con l’equilibrio redox e la regolazione dello stato cellulare.

γ Enolase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ENO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γ Enolase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ENO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ENO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γ Enolase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ENO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γ Enolase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γ Enolase nelle cellule tumorali con espressione di ENO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.