α_1A-AR Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419021-ACT

Il gene murino Adra1a codifica il recettore adrenergico alfa1A (α1A-AR), un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) che si associa prevalentemente a Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, aumentare la segnalazione IP3/DAG, mobilizzare il Ca2+ intracellulare e stimolare risposte dipendenti dalla PKC. La segnalazione di α1A-AR modula il tono della muscolatura liscia, la resistenza vascolare e la regolazione simpatica nei tessuti cardiovascolari e urogenitali, e influenza anche l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale. L’attivazione delle vie a valle interseca la segnalazione MAPK/ERK e programmi trascrizionali che controllano contrazione, metabolismo e risposte allo stress. Un’attività recettoriale adrenergica disregolata e un’espressione recettoriale alterata sono state implicate in modelli di ipertensione, disfunzioni del tratto urinario inferiore e fenotipi neurocomportamentali, supportando Adra1a come bersaglio per studi meccanicistici delle reti di segnalazione simpatica.

α1A-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Adra1a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α1A-AR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Adra1a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Adra1a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α1A-AR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Adra1a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α1A-AR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α1A-AR nelle cellule tumorali con espressione di Adra1a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.