YT521-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406333-ACT

Lo YTHDC1 umano codifica YT521-B, un lettore nucleare contenente il dominio YTH della N6-metiladenosina (m6A), che collega la metilazione dell’RNA allo splicing del pre-mRNA, all’esportazione dell’mRNA e al metabolismo nucleare dell’RNA. Legandosi ai trascritti modificati con m6A e coordinando la selezione dei siti di splicing con fattori di splicing ricchi in serina/arginina, YT521-B contribuisce a plasmare la produzione di isoforme trascrittomiche e i programmi di espressione genica. La regolazione dipendente da YTHDC1 interseca l’elaborazione dell’RNA associata alla cromatina e le reti trascrizionali responsabili allo stress che influenzano il controllo del ciclo cellulare e la differenziazione. La deregolazione della segnalazione m6A e i pattern anomali di splicing dell’RNA implicano le vie associate a YTHDC1 in stati trascrizionali oncogenici e in fenotipi del neurosviluppo, a supporto di studi meccanicistici in modelli rilevanti per la malattia.

YT521-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di YTHDC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

YT521-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus YTHDC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione YTHDC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di YT521-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus YTHDC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da YT521-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via YT521-B nelle cellule tumorali con espressione di YTHDC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.