YAP Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423742-ACT

Mouse Yap1 codifica YAP, un co-attivatore trascrizionale che funge da effettore centrale della via di segnalazione Hippo, integrando segnali meccanici, polarità cellulare e dinamiche del citoscheletro per controllare la proliferazione, la resistenza all’apoptosi e la crescita dei tessuti. Interagendo con i fattori di trascrizione della famiglia TEAD, YAP regola programmi genici coinvolti nel controllo delle dimensioni degli organi, nella rigenerazione e nei programmi epitelio–mesenchimali. Un’attività aberrante di YAP e la deregolazione della via Hippo sono implicate nella trasformazione oncogenica, nella fibrosi e nell’alterazione del comportamento delle cellule staminali/progenitrici, rendendo Yap1 un bersaglio frequente negli studi di mappatura delle vie di segnalazione. Nei modelli murini, la trascrizione dipendente da YAP è ampiamente utilizzata per indagare il patterning dello sviluppo e le risposte specifiche del contesto alla rigidità della matrice extracellulare e alla segnalazione mediata da GPCR.

YAP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Yap1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

YAP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Yap1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Yap1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di YAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Yap1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da YAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via YAP nelle cellule tumorali con espressione di Yap1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.