XRN1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401910-ACT

XRN1 umano codifica un’esoribonucleasi 5′–3′ altamente conservata che guida la degradazione citoplasmatica degli mRNA degradando i trascritti decappati ed eliminando i frammenti di RNA generati durante il turnover dell’RNA. XRN1 si coordina con i fattori di decapping e con i processing bodies per mantenere l’omeostasi del trascrittoma, influenzando vie quali la degradazione mediata da codoni di stop prematuri (nonsense-mediated decay), il silenziamento mediato da microRNA e il riconoscimento immunitario innato di RNA aberranti. Regolando la stabilità di mRNA coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, nella differenziazione e nelle risposte allo stress, XRN1 contribuisce a mantenere la proteostasi e la fedeltà della segnalazione. Una degradazione dell’RNA deregolata e un’attività alterata di XRN1 sono state collegate a programmi di espressione genica anomali osservati in biologia del cancro, a fenotipi di neurosviluppo e alle interazioni virus–ospite, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici della regolazione post-trascrizionale.

XRN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XRN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

XRN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XRN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XRN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di XRN1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XRN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da XRN1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via XRN1 nelle cellule tumorali con espressione di XRN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.