xCT Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424104-ACT

Slc7a11 del topo codifica xCT, la catena leggera del sistema xC⁻ che importa cistina extracellulare in scambio con glutammato intracellulare, sostenendo la sintesi intracellulare di cisteina e glutatione. Mantenendo l’equilibrio redox e limitando la perossidazione lipidica, xCT collega il trasporto di amminoacidi alle risposte allo stress ossidativo e alla sensibilità alla ferroptosi. Slc7a11 è regolato da programmi adattativi allo stress, tra cui NRF2 e ATF4, e interseca l’omeostasi del glutammato e la segnalazione infiammatoria in molteplici tessuti. Un’attività alterata di xCT è stata associata a modelli sperimentali di neurodegenerazione, attivazione immunitaria e metabolismo tumorale, attraverso i suoi ruoli nella capacità antiossidante e nella dinamica del glutammato extracellulare.

xCT Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc7a11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

xCT Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc7a11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc7a11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di xCT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc7a11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da xCT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via xCT nelle cellule tumorali con espressione di Slc7a11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.