XBP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400131-ACT

XBP1 (X-box binding protein 1) è un fattore di trascrizione bZIP che agisce come effettore centrale della risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR) a valle della segnalazione di stress del reticolo endoplasmatico (RE). In seguito allo splicing mediato da IRE1, XBP1 attivo programma reti trascrizionali che aumentano la capacità di ripiegamento del RE, potenziano la degradazione associata al RE (ERAD) e promuovono la biosintesi lipidica e l’omeostasi della via secretoria. L’attività di XBP1 influenza la differenziazione e la funzione dei tipi cellulari secretori e modella i programmi delle cellule immunitarie, inclusi lo sviluppo delle plasmacellule e gli output di segnalazione infiammatoria. La deregolazione della segnalazione XBP1/UPR è stata implicata nell’adattamento delle cellule tumorali allo stress proteotossico, nelle malattie metaboliche e nella neurodegenerazione, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studi meccanicistici sulla resilienza allo stress e sulla proteostasi.

XBP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

XBP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di XBP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da XBP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via XBP1 nelle cellule tumorali con espressione di XBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.