WWOX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403070-ACT

WWOX (ossidoreduttasi contenente domini WW) codifica una proteina associata alla soppressione tumorale, mappata sul sito fragile comune FRA16D, ed è implicata nel mantenimento della stabilità genomica. Nell’uomo, WWOX partecipa a reti di segnalazione che integrano apoptosi, risposte al danno del DNA e vie di stress cellulare, mediate in parte da interazioni dei domini WW con partner ricchi di prolina e dalla modulazione di regolatori della trascrizione. Un’alterazione dell’espressione di WWOX o una perdita di funzione è stata collegata alla trasformazione oncogenica e a fenotipi metastatici in molteplici contesti tissutali; inoltre, la sua compromissione genetica è associata anche a disturbi del neurosviluppo, inclusa l’encefalopatia epilettica. Queste caratteristiche rendono WWOX un nodo frequentemente studiato nelle vie che controllano proliferazione, differenziamento e morte cellulare.

WWOX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WWOX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WWOX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WWOX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WWOX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WWOX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WWOX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WWOX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WWOX nelle cellule tumorali con espressione di WWOX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.