Wolframin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423703-ACT

Il gene murino **Wfs1** codifica la wolframina, una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che contribuisce all’omeostasi del RE, alla capacità di ripiegamento proteico e alla regolazione della gestione del Ca²⁺ in tipi cellulari secretori ed eccitabili. La wolframina è collegata alla segnalazione dello stress del RE e alle vie della risposta alle proteine non correttamente ripiegate (unfolded protein response, UPR), che modulano l’adattamento cellulare agli squilibri della proteostasi. L’alterazione della funzione di **Wfs1** è associata a fenotipi neurodegenerativi e metabolici sindromici nei sistemi modello, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi che collegano la disfunzione del RE alla vulnerabilità neuronale e alla regolazione endocrina. Queste caratteristiche rendono **Wfs1** un nodo utile per analizzare le reti di adattamento allo stress e il crosstalk tra organelli.

Wolframin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Wfs1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wolframin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Wfs1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Wfs1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wolframin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Wfs1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wolframin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wolframin nelle cellule tumorali con espressione di Wfs1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.