Wnt-3a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400925-ACT

WNT3A codifica Wnt-3a, una glicoproteina secreta che attiva la via di segnalazione canonica Wnt/β-catenina attraverso complessi recettoriali Frizzled/LRP, regolando la specificazione del destino cellulare, la proliferazione e la patterning dei tessuti. Wnt-3a interagisce anche con vie Wnt non canoniche che influenzano la dinamica del citoscheletro e la migrazione cellulare, contribuendo a programmi trascrizionali dipendenti dal contesto. Un’espressione deregolata di WNT3A o l’attivazione della via sono implicate in anomalie dello sviluppo e vengono spesso studiate in modelli di segnalazione oncogenica, mantenimento delle cellule staminali e omeostasi tissutale. In quanto ligando upstream chiave, Wnt-3a è ampiamente utilizzata per indagare il crosstalk della via con le reti di segnalazione TGF-β, Notch e Hippo.

Wnt-3a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-3a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-3a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-3a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-3a nelle cellule tumorali con espressione di WNT3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.