Wnt-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400982-ACT

Il gene umano **WNT1** codifica la glicoproteina secreta **Wnt-1**, un ligando canonico della via Wnt che avvia la segnalazione attraverso i recettori **Frizzled/LRP** per stabilizzare **β-catenina** e regolare la trascrizione dipendente da **TCF/LEF**. Questa via controlla la specificazione del destino cellulare, la proliferazione e la differenziazione durante l’embriogenesi e l’omeostasi tissutale, con effetti a valle sul mantenimento delle cellule staminali e sul patterning morfogenetico. La deregolazione della segnalazione di **WNT1** e, più in generale, le perturbazioni della rete **Wnt/β-catenina** sono associate a disturbi dello sviluppo e a processi oncogeni tramite programmi trascrizionali alterati, dinamiche epitelio–mesenchimali e un controllo del ciclo cellulare dipendente dal contesto. Per questo **WNT1** è ampiamente utilizzato per studiare l’attivazione della via Wnt indotta da ligandi, la regolazione a feedback e il cross-talk con gli assi di segnalazione **MAPK**, **PI3K/AKT** e **BMP** in modelli cellulari umani.

Wnt-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-1 nelle cellule tumorali con espressione di WNT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.