WIF-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402389-ACT

WIF1 codifica il fattore inibitorio di Wnt 1 (WIF-1), un antagonista extracellulare secreto che si lega ai ligandi WNT e ne limita l’interazione con i recettori, attenuando così i programmi trascrizionali canonici mediati da β-catenina/TCF e i relativi output della segnalazione Wnt non canonica. Limitando il controllo esercitato da Wnt su proliferazione, differenziamento e patterning tissutale, WIF-1 contribuisce alla regolazione del comportamento delle cellule staminali/progenitrici e dei gradienti di segnalazione extracellulari. Una ridotta espressione di WIF1 è frequentemente associata ad attività aberrante della via Wnt e ad alterazioni delle caratteristiche epitelio-mesenchimali in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi la trasformazione oncogenica e il rimodellamento fibrotico. In quanto modulatore della disponibilità dei ligandi, WIF-1 è spesso studiato nel cross-talk di via con le reti di segnalazione Hedgehog, TGF-β e infiammatorie, che convergono sul destino cellulare e sull’omeostasi della matrice.

WIF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WIF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WIF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WIF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WIF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WIF-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WIF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WIF-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WIF-1 nelle cellule tumorali con espressione di WIF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.