WDR77 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403890-ACT

WDR77 (nota anche come MEP50) codifica una proteina di impalcatura con ripetizioni WD che funge da cofattore essenziale di PRMT5, coordinando la dimetilazione simmetrica di residui di arginina su istoni e su diverse proteine leganti l’RNA. Attraverso questo complesso PRMT5–WDR77, WDR77 contribuisce al rimodellamento della cromatina, alla regolazione della trascrizione e ai programmi di splicing dell’RNA che governano la progressione del ciclo cellulare e l’espressione genica specifica di linea. Le reti di metilazione associate a WDR77 intersecano vie che controllano le risposte al danno del DNA e la trascrizione dipendente dai segnali, collegando la regolazione epigenetica agli stati proliferativi cellulari. La disregolazione dell’attività di PRMT5/WDR77 e delle firme di metilazione a valle è stata riportata in molteplici contesti tumorali e dello sviluppo, motivando studi meccanicistici sul controllo genico dipendente da WDR77.

WDR77 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WDR77 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WDR77 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WDR77 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WDR77, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WDR77. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WDR77 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WDR77 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WDR77 nelle cellule tumorali con espressione di WDR77 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.