WAPL Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-432331-ACT

WAPL murino (Wapl) codifica un fattore di rilascio della coesina che regola l’associazione dinamica della coesina con la cromatina, contribuendo a plasmare l’organizzazione genomica di ordine superiore e la coesione delle cromatidi sorelle. Promuovendo lo scaricamento della coesina durante l’interfase e la progressione mitotica, WAPL influenza la tempistica della replicazione del DNA, la regolazione trascrizionale e la corretta segregazione dei cromosomi. L’attività di WAPL interseca inoltre i processi di risposta al danno e riparazione del DNA modulando la stabilizzazione, dipendente dalla coesina, delle forcelle di replicazione bloccate e dei foci di riparazione. Una dinamica della coesina deregolata e un’espressione alterata di WAPL sono state associate a instabilità genomica e a fenotipi legati alle coesinopatie, rendendo Wapl un nodo utile per lo studio dell’architettura della cromatina e del controllo del ciclo cellulare in modelli rilevanti per la malattia.

WAPL Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Wapl senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WAPL Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Wapl nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Wapl, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WAPL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Wapl nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WAPL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WAPL nelle cellule tumorali con espressione di Wapl silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.