Waf1/Cip1/CDKN1A p21 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419607-ACT

Cdkn1a codifica l’inibitore delle chinasi ciclina‑dipendenti p21 (Waf1/Cip1/CDKN1A), un effettore centrale del controllo del ciclo cellulare dipendente da p53 che limita l’attività di CDK2/CDK4 e impone l’arresto al checkpoint G1/S. Modulando i complessi ciclina–CDK e la replicazione e riparazione del DNA associate al PCNA (antigene nucleare delle cellule in proliferazione), p21 integra la segnalazione del danno al DNA con senescenza, differenziamento e risposte allo stress. Un’alterata regolazione di Cdkn1a è spesso collegata a proliferazione deregolata, mantenimento del genoma compromesso e cambiamenti dipendenti dal contesto nei programmi di apoptosi e senescenza in modelli di tumorigenesi e lesione tissutale. In quanto nodo in reti responsivi a p53, MAPK e TGF‑β, p21 è ampiamente utilizzato per valutare l’integrità dei checkpoint, lo stress replicativo e i fenotipi di invecchiamento cellulare nei sistemi murini.

Waf1/Cip1/CDKN1A p21 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cdkn1a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Waf1/Cip1/CDKN1A p21 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cdkn1a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cdkn1a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Waf1/Cip1/CDKN1A p21. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cdkn1a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Waf1/Cip1/CDKN1A p21 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Waf1/Cip1/CDKN1A p21 nelle cellule tumorali con espressione di Cdkn1a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.