VPS45 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411599-ACT

VPS45 codifica un regolatore conservato del traffico vescicolare della famiglia Sec1/Munc18, che coordina gli eventi di fusione di membrana dipendenti dalle SNARE necessari per il trasporto dagli endosomi al Golgi e per la maturazione endosomiale. Nelle cellule umane, VPS45 sostiene la stabilità e la funzione del macchinario di tethering correlato a HOPS/CORVET e contribuisce a mantenere lo smistamento del carico, il riciclo dei recettori e il traffico diretto verso i lisosomi. L’alterazione del traffico dipendente da VPS45 compromette l’omeostasi degli organelli, influisce sulle vie autofagia–lisosoma e può modificare l’output di segnalazione cambiando la disponibilità dei recettori sulla membrana plasmatica. Studi genetici e funzionali collegano la disfunzione di VPS45 a fenotipi immunitari ed ematopoietici, rendendolo rilevante per ricerche meccanicistiche sui difetti del trasporto intracellulare e sulle loro conseguenze cellulari a valle.

VPS45 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS45 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS45 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS45 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS45, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS45. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS45 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS45 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS45 nelle cellule tumorali con espressione di VPS45 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.