VPS41 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403666-ACT

VPS41 codifica una subunità fondamentale del complesso di tethering HOPS, che coordina la fusione endosoma–lisosoma e la maturazione degli endosomi tardivi attraverso interazioni con le GTPasi Rab e con il macchinario SNARE. Facilitando il trasporto del carico ai lisosomi, VPS41 contribuisce al flusso autofagico, alla downregolazione dei recettori e al turnover degli organelli danneggiati, integrandosi con le reti di traffico vescicolare che mantengono la proteostasi cellulare. L’alterazione del traffico dipendente da HOPS è associata a disfunzione lisosomiale, autofagia compromessa e modifiche degli output di segnalazione, processi spesso implicati nella neurodegenerazione e nella biologia delle cellule tumorali. Per questo motivo, VPS41 umano è ampiamente studiato in vie che regolano l’omeostasi endolisosomiale, le risposte allo stress e il trasporto intracellulare.

VPS41 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS41 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS41 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS41 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS41, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS41. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS41 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS41 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS41 nelle cellule tumorali con espressione di VPS41 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.