Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS41: sc-403666-ACT

VPS41 code une sous-unité essentielle du complexe d’arrimage HOPS, qui coordonne la fusion endosome–lysosome et la maturation des endosomes tardifs via des interactions avec les GTPases Rab et la machinerie SNARE. En facilitant l’acheminement du cargo vers les lysosomes, VPS41 contribue au flux autophagique, à la diminution des récepteurs et au renouvellement des organites endommagés, en s’intégrant aux réseaux de trafic vésiculaire qui maintiennent la protéostasie cellulaire. La perturbation du trafic dépendant de HOPS est associée à un dysfonctionnement lysosomal, à une autophagie altérée et à des modifications des voies de signalisation, des processus fréquemment impliqués dans la neurodégénérescence et la biologie des cellules cancéreuses. VPS41 humain est donc largement étudié dans les voies qui régissent l’homéostasie endolysosomale, les réponses au stress et le transport intracellulaire.

VPS41 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS41 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS41 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS41 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS41, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS41. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS41 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS41 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS41 dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS41 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.