Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS35: sc-402019-ACT

VPS35 code une sous-unité centrale du complexe rétromère, qui régit le transport de retour des endosomes vers le réseau trans-Golgi ainsi que le recyclage endosomal de nombreuses protéines cargos, contribuant ainsi au maintien de l’homéostasie des protéines membranaires et de l’intégrité des organites. Grâce à ses interactions avec les sortines (sorting nexins) et le complexe WASH, VPS35 participe à la coordination de la tubulation endosomale, de la dynamique de l’actine et des voies de trafic qui influencent la signalisation des récepteurs, la fonction lysosomale et l’autophagie. Une perturbation du tri dépendant de VPS35 peut altérer le contrôle qualité mitochondrial et la protéostasie, reliant le dysfonctionnement du rétromère à la neurodégénérescence et à d’autres troubles associés à un trafic endolysosomal défectueux. En tant que nœud central des voies de transport intracellulaire, VPS35 est largement utilisé pour étudier les mécanismes de tri des cargos, le maintien des synapses et les réponses au stress dans des modèles de cellules humaines.

VPS35 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS35 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS35 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS35 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS35, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS35. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS35 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS35 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS35 dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS35 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.