VPS26B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410249-ACT

VPS26B codifica un componente centrale del complesso retromer, che governa lo smistamento del carico endosomiale e il riciclo dagli endosomi verso la rete trans-Golgi e la membrana plasmatica. Coordinandosi con VPS35 e VPS29, VPS26B contribuisce a mantenere l’omeostasi delle proteine di membrana, regola il traffico dei recettori e supporta la funzione lisosomiale limitando un’anomala maturazione degli endosomi. Le vie dipendenti dal retromer influenzano la segnalazione cellulare, la localizzazione dei trasportatori di nutrienti e la proteostasi intracellulare, collegando l’attività di VPS26B a processi più ampi come l’autofagia e le risposte allo stress endolisosomiale. La disregolazione del traffico endosomiale e della funzione del retromer è stata implicata in fenotipi neurodegenerativi e dello sviluppo, rendendo VPS26B un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla biologia delle malattie associate al traffico di membrana.

VPS26B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS26B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS26B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS26B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS26B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS26B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS26B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS26B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS26B nelle cellule tumorali con espressione di VPS26B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.