VGLUT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403888-ACT

SLC17A6 codifica il trasportatore vescicolare del glutammato 2 (VGLUT2), una proteina di membrana delle vescicole sinaptiche che carica il glutammato nelle vescicole presinaptiche per sostenere la neurotrasmissione eccitatoria. Controllando il contenuto vescicolare di glutammato e il rilascio quantale, VGLUT2 contribuisce a modellare la forza sinaptica, lo sviluppo dei circuiti e la plasticità dipendente dall’attività nei neuroni centrali e periferici. La funzione di VGLUT2 interseca il traffico vescicolare, i gradienti elettrochimici di protoni stabiliti dalla V-ATPasi e le vie di segnalazione glutammatergiche che regolano l’eccitabilità neuronale e la sincronizzazione delle reti. Alterazioni nella gestione del glutammato e nell’equilibrio eccitatorio/inibitorio implicano i processi regolati da SLC17A6 in fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, nonché in meccanismi rilevanti per lo stress eccitotossico.

VGLUT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC17A6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VGLUT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC17A6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC17A6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VGLUT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC17A6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VGLUT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VGLUT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC17A6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.