VGAT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401850-ACT

SLC32A1 codifica il trasportatore vescicolare del GABA (VGAT), una proteina di membrana delle vescicole sinaptiche che carica GABA e glicina nelle vescicole secretorie, consentendo la neurotrasmissione inibitoria. Controllando l’assorbimento vescicolare e la dimensione quantale, VGAT regola l’equilibrio eccitazione–inibizione, la plasticità sinaptica e le oscillazioni delle reti neuronali in tutto il sistema nervoso centrale. L’alterazione della segnalazione inibitoria, associata a un’attività deregolata di SLC32A1/VGAT, è rilevante per studi su epilessia, fenotipi legati all’ansia, disturbi del neurosviluppo e disturbi del movimento, in cui l’inibizione a livello di circuito risulta perturbata. In quanto trasportatore vescicolare, la funzione di VGAT si interseca con il ciclo delle vescicole sinaptiche, il metabolismo dei neurotrasmettitori e i processi di trasporto dipendenti dai gradienti ionici che determinano l’efficacia delle sinapsi inibitorie.

VGAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC32A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VGAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC32A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC32A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VGAT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC32A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VGAT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VGAT nelle cellule tumorali con espressione di SLC32A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.