VDAC1/Porin Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-418200-ACT-2

Il VDAC1 umano (voltage-dependent anion-selective channel 1), noto anche come porina, è un canale della membrana esterna mitocondriale che regola lo scambio di ATP/ADP, metaboliti e ioni tra mitocondri e citosol, coordinando così la bioenergetica cellulare e l’omeostasi redox. Interagisce con l’esochinasi e con le proteine della famiglia BCL-2 per modulare la permeabilità mitocondriale, la gestione del calcio nei siti di contatto mitocondrio–reticolo endoplasmatico e i processi legati all’apoptosi, collegando la dinamica mitocondriale alla segnalazione da stress. Un’espressione o un’attività di canale di VDAC1 deregolate sono state associate a un’alterata riprogrammazione metabolica e alla disfunzione mitocondriale osservate in contesti quali il cancro, i disturbi neurodegenerativi e le malattie cardiovascolari. L’editing genetico mirato a VDAC1 è comunemente impiegato per analizzare i meccanismi di trasporto mitocondriale, mappare le reti di interazione proteina–proteina sulla membrana esterna del mitocondrio e stabilire ruoli causali di VDAC1 nella suscettibilità alla morte cellulare e nell’adattamento delle vie metaboliche.

VDAC1/Porin Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VDAC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VDAC1/Porin Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VDAC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VDAC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VDAC1/Porin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VDAC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VDAC1/Porin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VDAC1/Porin nelle cellule tumorali con espressione di VDAC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.