VCP Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401052-LAC

La VCP umana (valosin-containing protein; p97) è un’ATPasi AAA+ che funziona come segregasi centrale nel controllo di qualità delle proteine dipendente dall’ubiquitina. Estrae i substrati ubiquitinati dai complessi proteici e dalle membrane per supportare la degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD), il turnover proteasomiale, i processi associati alla cromatina e l’autofagia, mantenendo così la proteostasi durante lo stress cellulare. L’attività di VCP interseca il sistema ubiquitina–proteasoma, la segnalazione dello stress del RE/UPR e le vie di traffico di membrana, con effetti a valle sull’omeostasi mitocondriale e sulla segnalazione infiammatoria. Una funzione deregolata di VCP è stata collegata alla neurodegenerazione e a fenotipi di proteinopatia multisistemica, rendendola un nodo ampiamente utilizzato per studi meccanicistici sullo stress proteotossico e sulle vie cellulari di smaltimento.

Le particelle di attivazione lentivirale VCP (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di VCP in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale VCP (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione VCP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di VCP. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo VCP e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.