VASP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401104-ACT

Humanes VASP (vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein) ist ein Aktin-regulierendes Protein der Ena/VASP-Familie, das während der Zell-Ausbreitung und Zellmotilität die Verlängerung von Aktinfilamenten, die Dynamik fokaler Adhäsionen und Membranprotrusionen koordiniert. Über Interaktionen mit Profilin-Aktin und F‑Aktin integriert VASP Signale nachgeschalteter cAMP-/cGMP-abhängiger Kinasen sowie von Signalwegen der Rho-Familie von GTPasen, um das zytoskelettale Remodeling und die Zell‑Zell- bzw. Zell‑Matrix-Adhäsion fein abzustimmen. Die VASP-abhängige Kontrolle der Endothelbarriere, der Thrombozytenaktivierung und der gerichteten Migration verknüpft diesen Knotenpunkt mit Prozessen, die für Gefäßbiologie, Entzündung und invasives Zellverhalten relevant sind. Eine veränderte VASP-Aktivität oder -Expression wurde u. a. im Kontext des kardiovaskulären Remodelings und der krebsassoziierten Migration untersucht, wodurch VASP ein nützlicher Ansatzpunkt zur Untersuchung aktingetriebener Phänotypen ist.

VASP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VASP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VASP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VASP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VASP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VASP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VASP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VASP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VASP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VASP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.