urocortin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403604-ACT

L’UCN umano codifica l’urocortina, un neuropeptide secreto appartenente alla famiglia del fattore di rilascio della corticotropina (CRF), che segnala principalmente attraverso CRHR2 e CRHR1 per modulare programmi trascrizionali dipendenti da cAMP/PKA. L’urocortina partecipa alle risposte neuroendocrine allo stress e coordina processi cellulari che includono la secrezione, l’adattamento metabolico e la segnalazione infiammatoria in tessuti centrali e periferici. Tramite le vie dei recettori CRH, UCN influenza il tono vascolare, la funzione gastrointestinale e la fisiologia cardiaca, collegando la sua espressione a studi sulla biologia dello stress e sulla regolazione cardiometabolica. Alterazioni della segnalazione dell’urocortina sono state esplorate in contesti quali fenotipi correlati ad ansia e depressione, scompenso cardiaco e condizioni infiammatorie, supportando la ricerca meccanicistica sulla disregolazione dell’asse CRH.

urocortin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UCN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

urocortin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UCN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UCN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di urocortin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UCN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da urocortin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via urocortin nelle cellule tumorali con espressione di UCN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.