UCP3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400866-ACT

La UCP3 umana (uncoupling protein 3) è un trasportatore della membrana interna mitocondriale che modula la perdita di protoni e influenza l’efficienza di accoppiamento della fosforilazione ossidativa, plasmando la produzione di ATP, l’equilibrio delle specie reattive dell’ossigeno e la generazione di calore nei tessuti metabolicamente attivi. È strettamente collegata all’ossidazione degli acidi grassi e al controllo di qualità mitocondriale, con ruoli nella regolazione dell’utilizzo dei substrati durante lo stress da carenza di nutrienti e in condizioni di elevato flusso lipidico. Un’alterata espressione di UCP3 è stata associata a insulino-resistenza, disfunzione metabolica legata all’obesità e fenotipi mitocondriali del muscolo scheletrico, supportandone l’uso come nodo per lo studio dell’omeostasi energetica. UCP3 è quindi rilevante per vie che integrano la respirazione mitocondriale, la gestione dei lipidi e la segnalazione redox nel metabolismo cellulare e dell’organismo.

UCP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UCP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UCP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UCP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UCP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UCP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UCP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UCP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UCP3 nelle cellule tumorali con espressione di UCP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.