UCH-L1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401088-ACT

UCHL1 codifica per l’ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1), un enzima deubiquitinante arricchito nei neuroni che regola l’omeostasi dell’ubiquitina e la proteostasi processando i precursori dell’ubiquitina e riciclando l’ubiquitina da substrati coniugati. Grazie ai suoi ruoli nel sistema ubiquitina–proteasoma e nel controllo della qualità proteica, UCH-L1 influenza la funzione sinaptica, l’integrità assonale e le risposte cellulari allo stress proteotossico. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di UCHL1 sono state associate a processi neurodegenerativi, inclusi percorsi legati all’aggregazione proteica e alla vulnerabilità neuronale, e il gene è studiato anche in contesti di biologia tumorale e regolazione dello stato cellulare. Queste caratteristiche rendono UCHL1 un bersaglio utile per indagare la segnalazione dipendente dall’ubiquitina, la differenziazione neuronale e i fenotipi di risposta allo stress in sistemi modello umani.

UCH-L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UCHL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UCH-L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UCHL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UCHL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UCH-L1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UCHL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UCH-L1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UCH-L1 nelle cellule tumorali con espressione di UCHL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.