UBC13 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417204-ACT

UBE2N umano codifica l’enzima E2 coniugante l’ubiquitina UBC13, un catalizzatore chiave della poliubiquitinazione con legami su Lys63 (K63) che modella esiti di segnalazione non proteolitici. In complesso con cofattori UEV come UBE2V1/UBE2V2, UBC13 favorisce l’assemblaggio di catene di ubiquitina K63 che coordinano le risposte al danno del DNA, la tolleranza allo stress replicativo e la segnalazione dell’immunità innata. Questa attività è centrale per l’attivazione di vie tra cui NF-κB e MAPK a valle di recettori come TNFR e i recettori Toll-like, e influenza la dinamica dei complessi proteici più che il turnover proteasomiale. Una deregolazione della segnalazione ubiquitinica dipendente da UBE2N/UBC13 è stata implicata in stati infiammatori alterati, difetti di stabilità genomica e rimodulazione oncogena delle vie di segnalazione, rendendola rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro e immunologia.

UBC13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBE2N senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UBC13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBE2N nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBE2N, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UBC13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBE2N nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UBC13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UBC13 nelle cellule tumorali con espressione di UBE2N silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.