UBA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404495-ACT

UBA2 codifica la subunità 2 dell’enzima attivante SUMO, che forma un eterodimero con SAE1 per costituire l’enzima E1 che avvia la SUMOilazione adenilando SUMO e trasferendolo all’enzima coniugante E2 UBC9. Questa via regola la stabilità proteica, la localizzazione subcellulare e l’attività in processi chiave, tra cui la segnalazione del danno al DNA, l’organizzazione della cromatina, il controllo trascrizionale e la progressione del ciclo cellulare. La SUMOilazione dipendente da UBA2 influenza le risposte allo stress e la proteostasi attraverso il coordinamento con reti di modificazione di tipo ubiquitina-like. Un’alterata attività della via SUMO, inclusa una funzione o un’espressione di UBA2 modificate, è stata implicata in programmi trascrizionali oncogeni e in difetti di mantenimento del genoma rilevanti per la biologia del cancro e per altri fenotipi proliferativi o associati allo stress.

UBA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UBA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UBA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UBA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UBA2 nelle cellule tumorali con espressione di UBA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.