twist Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-414117-ACT

Il gene umano **TWIST2** codifica **Twist**, un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix (bHLH) che regola la determinazione di linea, la differenziazione mesenchimale e la morfogenesi dei tessuti. Twist integra i segnali dello sviluppo con programmi trascrizionali che controllano l’identità cellulare, il rimodellamento della matrice extracellulare e i processi correlati alla transizione epitelio-mesenchimale. Modula reti geniche coinvolte nello sviluppo craniofacciale e degli arti e influenza stati trascrizionali dei fibroblasti e correlati al sistema immunitario. Un’attività dis-regolata di TWIST2 è stata associata a sindromi congenite dello sviluppo e ad alterazioni della biologia stromale, rendendolo un nodo utile per studiare i circuiti di regolazione genica in modelli cellulari rilevanti per lo sviluppo e la malattia.

twist2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TWIST2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

twist2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TWIST2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TWIST2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di twist2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TWIST2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da twist2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via twist2 nelle cellule tumorali con espressione di TWIST2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.