twist Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400108-ACT

Il gene umano **TWIST1** codifica Twist, un fattore di trascrizione della famiglia **basic helix–loop–helix (bHLH)** che coordina i programmi di linea mesenchimale e regola la **transizione epitelio–mesenchimale (EMT)** attraverso il controllo trascrizionale di geni coinvolti nell’adesione cellulare, nella motilità e nel rimodellamento della matrice extracellulare. TWIST1 integra segnali provenienti da vie dello sviluppo e da vie responsivi allo stress, tra cui **TGF-β**, **WNT/β-catenina** e **PI3K/AKT**, per modulare proliferazione, differenziamento e sopravvivenza. Un’attività deregolata di TWIST1 è associata a una morfogenesi alterata e a stati anomali di tipo EMT, frequentemente studiati in modelli di progressione tumorale, invasione e metastasi, così come nella fibrosi e in fenotipi cellulari simil-staminali. In quanto regolatore nodale della plasticità trascrizionale, TWIST1 è ampiamente utilizzato per esplorare le reti di regolazione genica che governano le transizioni di stato cellulare.

twist Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TWIST1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

twist Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TWIST1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TWIST1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di twist. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TWIST1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da twist nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via twist nelle cellule tumorali con espressione di TWIST1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.