TRPV5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403668-ACT

TRPV5 kodiert einen hochgradig kalziumselektiven, konstitutiv aktiven TRP-Kationenkanal, der überwiegend in der apikalen Membran epithelialer Zellen lokalisiert ist und dort den transzellulären Ca2+-Einstrom vermittelt. Die Kanalaktivität ist mit Signalwegen der Calciumhomöostase koordiniert, darunter die Pufferung durch Calbindin sowie die basolaterale Extrusion über den Na+/Ca2+-Austauscher und Ca2+-ATPasen, und wird durch Faktoren wie intrazelluläres Ca2+, pH-Wert und kalziotrope Signalgebung moduliert. Die TRPV5-Funktion ist eng mit epithelialen Ionentransportprogrammen und der Physiologie der Calciumrückresorption verknüpft und stellt damit einen relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung des Mineralstoffwechsels und des epithelialen Barrieretransports dar. Eine dysregulierte TRPV5-Expression oder -Aktivität wurde mit veränderten Phänotypen der Calciumhandhabung in Verbindung gebracht und in Zusammenhängen von Störungen der renalen und systemischen Calciumbilanz untersucht.

TRPV5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRPV5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRPV5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRPV5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRPV5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRPV5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRPV5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRPV5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRPV5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRPV5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.