TRPV4 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401432-LAC

TRPV4 codifica un canale TRP polimodale permeabile al Ca2+ che, a livello della membrana plasmatica, funziona da meccanosensore e osmosensore, collegando stimoli fisici e chimici alla segnalazione intracellulare del calcio. L’attivazione del canale regola il potenziale di membrana e vie Ca2+-dipendenti che controllano il rimodellamento del citoscheletro, la regolazione del volume cellulare e risposte trascrizionali, incluse le cascate di segnalazione dipendenti da MAPK e CaMK. L’attività di TRPV4 influenza la permeabilità endoteliale, la segnalazione nocicettiva e infiammatoria e la meccanotrasduzione in cartilagine e osso, collegandolo a processi rilevanti per edema, sensibilizzazione al dolore e omeostasi scheletrica. Alterazioni genetiche e funzionali di TRPV4 sono state associate a uno spettro di fenotipi neuropatici e di displasie scheletriche, rendendolo un bersaglio utile per studiare la dinamica del Ca2+ evocata da stimoli e i programmi genici a valle.

Le particelle di attivazione lentivirale TRPV4 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di TRPV4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale TRPV4 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione TRPV4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di TRPV4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo TRPV4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.